丙酮酸羧化酶是糖異生途徑的關鍵酶。丙酮酸羧化酶存在於線粒體中，是催化下列不可逆反應的酶。丙酮酸羧化酶EC6．4．1．1．丙酮酸+CO2+ATP+H2O→草酰乙酸+ADP+Pi，ΔGo′=-0.5kcal．廣泛存在於動物、黴菌和酵母中，但在植物體和大部分細菌中卻不含此酶。在三羧酸循環中，它是供給草酰乙酸的主要補充反應。爲一種變構酶，有乙酰CoA時，其活性存在，同時含有生物素作爲和CO2反應的酶的輔酶。分子量約65萬，有很多亞基。最適pH爲4.8。
