退火溫度確定的計算公式是：4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8）。退火溫度（AnnealingTemperature）是指引物和模板結合時候的溫度參數，當50%的引物和互補序列表現爲雙鏈DNA分子時的溫度。它是影響PCR特異性的較重要因素。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。
