在反相液相色譜中，固定相的極性小於流動相，洗脫順序取決於溶質分子的疏水性，疏水性強的保留時間長。反相高效液相色譜是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是當今液相色譜的最主要的分離模式，幾乎可用於所有能溶於極性或弱極性溶劑中的有機物的分離。 反相色譜法適於分離非極性、極性或離子型化合物，大部分的分析任務皆由反相色譜法完成。
